Một trong những mối quan tâm hàng đầu của Elizabeth I khi bắt đầu trị vì là các vấn đề tôn giáo. Nhận biết thần dân muốn Nữ vương khước từ quyền lực của Giáo hoàng và ảnh hưởng của Tây Ban Nha, điều này phù hợp với ước nguyện của bà và những quyết sách được đề nghị bởi Sir William Cecil. Elizabeth cũng biết Giáo hoàng sẽ không chịu công nhận bà là con hợp pháp của Henry VIII và là quân vương của nước Anh.[26] Vì vậy, Nữ vương quyết định thành lập một giáo hội Kháng Cách phù hợp với nguyện vọng người dân Anh.[27] Năm 1559, Quốc hội làm luật thành lập giáo hội theo mô hình của Edward VI, với nhà vua là người đứng đầu giáo hội.[27] Dự luật nhận được sự ủng hộ mạnh mẽ tại Viện Thứ dân, nhưng gặp chống đối tại Viện Quý tộc, đặc biệt là từ các Giám mục. Tuy nhiên, may mắn cho Elizabeth, nhiều vị trí Giám mục đang khuyết, kể cả chức vụ Tổng Giám mục thành Canterbury.[28][29] Điều này giúp các thành viên Viện Quý tộc ủng hộ Kháng Cách chiếm đa số phiếu khi biểu quyết. Đạo luật Đồng nhất (Act of Uniformity) được Nữ vương phê chuẩn năm 1559, quy định việc sử dụng Sách Cầu nguyện chung theo đức tin Kháng Cách trong các nhà thờ.[30] Bí tích Thánh thể của Giáo hội Công giáo bị bác bỏ. Nữ vương nhận danh hiệu "Thống đốc Tối cao của Giáo hội Anh" thay vì "Đầu của Giáo hội".

Đạo luật Quyền Tối thượng năm 1559 buộc tất cả viên chức công phải chấp nhận quyền kiểm soát của nhà vua trên giáo hội. Nhiều Giám mục từ chối ủng hộ lập trường của Elizabeth bị bãi chức và được thay thế bởi những chức sắc ủng hộ Nữ vương. Bà bổ nhiệm Hội đồng Tư vấn mới, không còn có sự hiện diện của các thành viên Công giáo. Dưới triều Elizabeth, tình trạng chia rẽ và tranh chấp do bè phái giảm thiểu đáng kể. Cố vấn trưởng của Nữ vương, Sir William Cecil, đảm nhiệm chức Bộ trưởng Ngoại giao, và Sir Nicholas Bacon làm Quan Chưởng ấn.

Nhiều tín hữu Công giáo, nhất là ở châu Âu đại lục, xem Elizabeth là dị giáo. Ngày 25 tháng 3 năm 1570, Giáo hoàng Piô V ra chỉ dụ Regnans in Excelsis phạt vạ tuyệt thông Elizabeth và gọi là bà là "Nữ vương tiếm vị".[31] Chỉ dụ này, trên lý thuyết giải phóng người Công giáo tại Anh khỏi nghĩa vụ trung thành với Elizabeth, lại khiến giáo hội Anh liên kết chặt chẽ với vương quyền và đặt người Công giáo tại Anh vào tình huống khó khăn[32]